Le contexte

Le Professeur Jean-Pierre BENOIT a une double activité, hospitalière et universitaire. Dans le cadre de cette dernière, il est également le directeur d'une UPRES Ill (Unité Propre de Recherche de l'Enseignement Supérieur, Equipe d'Accueil) composé d'une vingtaine de chercheurs, enseignants-chercheurs et personnel technique, de dix doctorants et quatre postdoctorants. Cette Unité a pour thème principal la vectorisation particulaire, allant de la conception de vecteurs à leur application clinique, en passant par leur expérimentation préclinique.
Lorsque certains programmes de recherche et de développement de vecteurs arrivent en phase clinique, se pose le problème de la préparation et du contrôle des lots cliniques. C'est à ce niveau qu'intervient la Pharmacie qui a la volonté de participer activement aux travaux de recherche clinique entrepris au CHU et qui dispose d'une infrastructure adaptée pour répondre à cet objectif.
Un exemple de développement de formes galéniques innovantes est donné avec les microsphéres biodégradables de 5-FU utilisées dans le traitement du glioblastome.

L'implication de la pharmacie

Le préparatoire de la Pharmacie dispose de salles à empoussièrement contrôlé (classe 100 et 10 000) validées selon les normes actuelles et qui permettent de fabriquer tout type de médicament en respectant les bonnes pratiques de fabrication.
Pour la fabrication des microsphères de 5-FU, la pharmacie dispose d'une installation pilote (réacteur de 6 L double enveloppe, système de filtration sous pression, système d'agitation...) permettant la production d'une dizaine de grammes de microsphères en une fois. A cela, il faut ajouter un poste de sécurité microbiologique utilisé pour le conditionnement des microsphères, un lyophilisateur et une étuve de désorption des solvants organiques permettant l'obtention d'une poudre sèche répondant aux normes de la pharmacopée en terme de solvant résiduel. Sur le plan du contrôle, la pharmacie a une parc d'équipement complet, lui permettant de faire lace à ses missions : chromatographie en phase gazeuse, chromatographie liquide haute performance, appareil de dissolution à palettes tournantes...
Une technicienne s'occupe des contrôles des microsphères et deux internes de la fabrication et de la gestion des lots cliniques de microsphéres de 5-FU.
Cet exemple de programme de recherche illustre ce que peut apporter un pharmacien hospitalier, Professeur des Universités à une pharmacie hospitalière. Il peut intervenir à deux niveaux :
- soit comme conseiller scientifique vis-à-vis de ses collègues médecins et initier des projets de recherche au sein de l'hôpital ;
- soit en développant activement les projets qui entrent dans son domaine d'expertise, en utilisant à la fois son infrastructure universitaire pour l'expérimentation préclinique, et le savoir faire d'une pharmacie hospitalière pour les études cliniques. 

Chimiothérapie interstitielle des gliomes malins par implantation intracérébrale de microsphère.

"L'équipe que j'anime a acquis ces dernières années la maîtrise de la microencapsulalion de nombreux principes actifs et une grande expérience dans l'ulilisalion des homo el copolymères des acides lactiques el glycolique, seule série de polymère pouvant être utilisés aujourd'hui dans la formulation d'implanls parentéraux biodégradables en médecine humaine.
Les technologies de microencapsulalion nous ont permis de concevoir de nouvelles formes galéniques permettant l'adminislralion intracérébrale de médicaments dans des pathologies pour lesquelles il n'existe aucune solution thérapeutique salisfaisanle, telles que les gliomes malins", dit Jean-Pierre BENOIT. 

Etat actuel du traitement des tumeurs gliales malignes

Les tumeurs gliales malignes sont des tumeurs primitives du système nerveux central. Elles représentent, selon les séries, 13 à 22% des tumeurs intracrâniennes. Le service de Neurochirurgie du CHU d'Angers opère 40 tumeurs gliales malignes par an. Leur traitement est limité principalement par trois phénomènes.
Le premier est l'existence d'une BHE qui isole le système nerveux central du reste de l'organisme- Cette BHE ne laisse passer que des molécules de petite taille et liposolubles. Les autres molécules doivent être administrées à des doses très importantes pour atteindre le système nerveux central et ce, au prix d'effets secondaires systémiques importants.
Le deuxième facteur limitant est le caractère infiltrant de ces tumeurs. Le cerveau étant un organe hautement fonctionnel, il est impossible d'y réaliser une chirurgie large, au sens carcinologique du terme. L'exérése la plus complète possible ne sera qu'une exérése macroscopique, laissant un grand nombre de cellules tumorales dispersées dans les parois de la cavité d'exérése (90% des tumeurs malignes opérées récidivent dans les deux centimètres du site tumoral initial).
Enfin le dernier facteur limitant est le faible index thérapeutique des traitements. Aussi est-il difficile de détruire les cellules tumorales sans détruire les cellules nerveuses normales. Le progrès réalisé dans le traitement de ces tumeurs sont quasi nuls. Les principaux essais thérapeutiques (étude de phase III) qui ont été conduits depuis plusieurs années par le Brain Tumor Cooperative Croup (BTCG), ont montré que la radiothérapie suivant l'exérése chirurgicale permet d'obtenir une survie plus longue (médiane de 9 mois) que celle obtenue après exérèse chirurgicale isolée (médiane de 4 mois).L'immunothérapie ne s'est jamais imposée, probablement en raison du polymorphisme antigénique de ces tumeurs. La thérapie génique qui apparaît comme une méthode d'avenir n'en est qu'à ses tout débuts.
Actuellement, le traitement classique des tumeurs gliales malignes comportant une résection chirurgicale suivie d'une radiothérapie externe ne permet qu'une médiane de survie inférieure à un an. 

Le concept d'implantation stéréotaxique de microsphères

Depuis peu, des systèmes déposés dans la paroi de résection tumorale de gliomes malins, ont été développés en vue de retarder la récidive tumorale et d'augmenter la survie des patient. Après exérése de la tumeur, des disques macroscopiques constitués d'un polymère biodégradable de type poly anhydride libérant du BCNU (Gliadel) sont appliqués par le neurochirurgien sur les parois de la cavité.
L'inconvénient majeur de cette stratégie est que la taille et la forme de ces systèmes nécessitent leur administration à ciel ouvert lors d'une intervention chirurgicale. De plus, les poly anhydrides ne sont pas agréés pour une utilisation clinique de large envergure. Enfin, l'efficacité de ce traitement est très discutée.
"Dans le contexte du traitemenl des gliomes, nous explorons depuis cinq ans une voie différente en utilisant :
- comme vecteur des implants micro particulaires et non pas monolithiques, autorisant une implantation multifocale et par méthodologie stéréotaxique,
- et, comme polymère constitulif du vecteur, le poly (d,l-acide lactique co-acide glycolique) qui est un polymère biodégradable autorisé dans la formulation de préparations galéniques implantables à libération prolongée (à la différence des poly anhydrides), le concept de microencapsulalion peut être associé à la sléréotaxie, ce qui fail l'originalité de notre démarche thérapeutique"
La taille des microsphéres étudiées permet de les implanter à travers une aiguille par méthodologie stéréotaxique. La stéréotaxie est basée sur le concept fondamental suivant lequel le cerveau est relativement immobile dans la boîte cranienne. Toute structure anatomique ou lésion pathologique située à l'intérieur du cerveau peut être définie dans l'espace, il est possible d'y implanter une électrode (qui permettra d'enregistrer, détruire ou stimuler une aire cérébrale précise), d'y réaliser une biopsie ou enfin d'y injecter un médicament.
Chez l'homme, le système référentiel permettant de définir les trois coordonnées dans l'espace du point choisi est constitué d'un cadre métallique solidement fixé sur le crâne du patient. La cible est repérée grâce à différents systèmes d'imagerie. Depuis l'avènement du scanner et plus récemment de l'lRM, la cible peut être directement visualisée et ses coordonnées directement calculées à partir de l'image. Cette stéréotaxie moderne permet des implantations multiples, répétées, dans des régions profondes du cerveau, sous anesthésie locale et sans risque majeur.
La rencontre de la microencapsulation et de la neurochirurgie stéréotaxique, rend possible d'implanter dans le cerveau, avec précision et sécurité, des particules microscopiques, pouvant libérer une molécule donnée pendant la période choisie, puis se dégradant pour disparaître. Cette démarche a été appliquée à la libération interstitielle de molécules antimitotiques après administration intracérébrale, afin de développer un traitement efficace des tumeurs gliales malignes. 

Résultats du programme

- Etude pharmacotechnique

La forme galénique retenue a été la microsphére d'une taille comprise entre 20 et 50 um. La méthode de préparation a été la technique par émulsion / extraction de solvant, connue pour permettre la microencapsulation de principes actifs de solubilité variée. La radiostérilisation des microsphéres préparées a été retenue comme procédé de stérilisation.
Dans un premier temps, des microsphéres blanches (sans principe actif) ont été préparées à partir de différents polymères dont le poly (d,l-acide lactique co-acide glycolique) 50/50 (PLAGA). Ces microsphéres ont permis la mise au point d'une méthodologie d'implantation stéréotaxique chez le rat et leur biocompatibilité a été systématiquement étudiée chez l'animal.
Dans un deuxième temps, plusieurs agents anticancéreux dont le 5-FU, ont été encapsulés, en retenant le PLAGA comme polymère support en raison de ses caractéristiques de biocompatibilité et biodégradabilité dans le tissu nerveux. De plus, ce composé appartient à la série des poly (a-hydroxyacides), seuls polymères ayant reçu à ce jour l'Autorisation de Mise sur le Marché des instances internationales de la Santé, pour la fabrication à large échelle d'implants pharmaceutiques biodégradables.
Le 5-FU est un antimitotique ancien et bien connu, introduit en thérapeutique dès 1958. Il est intéressant à vectoriser car son activité est augmentée par administration locale. C'est une molécule hydrophile qui passe très faiblement la BHL, ce qui explique son inefficacité par voie systémique sur les tumeurs gliales malignes chez l'animal comme chez l'homme.
Son activité est par ailleurs augmentée par une administration prolongée. Le 5-FU est un agent phase-dépendant qui détruit seulement les cellules qui sont dans le cycle actif et qui dupliquent leur ADN au moment de l'administration. Le 5-FU ne peut donc pas, suite à une administration systémique, détruire un nombre important de cellules malignes. Il est nécessaire que son administration couvre au moins la durée du cycle cellulaire du glioblastome humain (3 à 7 jours) pour bloquer la méthylation de l'uracile au moment de la duplication de l'ADN.
Le 5-FU est essentiellement actif sur les tissus à renouvellement rapide et est peu neurotoxique. Il est enfin radiosensibilisant.
La supériorité de l'association 5-FU-radiothérapie sur chacun de ces traitements isolés a été mise en évidence dès les années 60 sur des modèles animaux et sur des cellules tumorales in vitro. Comme le traitement actuel de référence des gliomes malins lait intervenir la radiothérapie, une synergie d'action en présence de 5-FU peut être espérée.
Le taux maximum d'encapsulation obtenu a été de 32% et les études de libération in vitro du 5-FU confirment bien que son encapsulation s'accompagne d'une libération progressive sur une période allant de quelques jours à 3 semaines et que la durée du relargage est influencée par la structure interne de la microsphère.

- Etude toxicologique

Dans cette phase du programme, deux aspects ont été abordés :
- la biocompatibilité de différents types de microsphères blanches avec le tissu nerveux, après implantation stéréotaxique chez le rat,
- la toxicité de microsphéres chargées en agent anticancéreux également après implantation intracérébrale chez le même animal.

La biocompatibilité avec le tissu nerveux

Les microsphères de PLAGA induisent après implantation une réaction histio-astrocytaire non spécifique et transitoire observée après implantation intracérébrale. Elle diminue de façon importante le premier mois alors que persistent des microsphéres. Ce décalage suggère qu'une grande partie des réactions observées est liée au traumatisme de l'implantation et non au polymère lui-même. L'absence de lymphocytes T visibles, à tous les stades étudiés, permet d'éliminer une éventuelle réaction immunologique.
Les microsphères de PLAGA peuvent donc être considérées comme biocompatibles avec le tissu cérébral. De plus, elles sont totalement résorbées en 2 mois.

Toxicité de microsphères chargées

La toxicité de différents traitements implantés par voie intracérébrale (microsphères blanches, microsphères de 5-FU) a été évaluée chez le rat sain. La croissance pondérale de chaque groupe a été comparée à celle d'animaux témoins.
Il a été mis en évidence une bonne tolérance des microsphères de PLAGA-5-FU implantées dans le cerveau de rats sains, bonne tolérance conservée si on accompagne l'implantation d'une irradiation cérébrale. Ce résultat est extrêmement intéressant car le 5-FU est une molécule radiosensibilisante et son action cytotoxique locale doit pouvoir être potentialisée par la radiothérapie, sans léser le tissu sain.

- Etude pharmacocinétique

Après administration par voie sous-cutanée de microsphères chargées chez le lapin sain, on observe que ces microparticules libèrent de manière progressive et constante le 5-FU sur une période d'au moins 28 jours. Ce résultat est particulièrement intéressant dans le cadre d'une implantation intracérébrale. En effet, d'une part, du fait de sa courte demi-vie après injection par voie intraveineuse et de son mode d'action qui est phase-dépendant, le 5-FU doit être administré de façon prolongée. D'autre part, le temps de doublement des gliomes malins est d'environ 6 semaines. Une libération du principe actif sur 4 semaines revêt donc ici toute son importance d'autant que les microsphères de PLAGA se dégradent dans ce laps de temps. Une ré-implantation de ces systèmes est donc tout à fait réalisable au bout de 5 semaines.
Il a aussi été possible d'apprécier la durée de libération du 5-FU dans le tissu cérébral. Les résultats obtenus viennent confirmer ceux de l'étude précédente.
Lors de l'implantation stéréotaxique des microsphéres, on n'a pas noté de passage du 5-FU dans la circulation systémique. On peut donc en déduire soit que le 5-FU ne passe pas la BHL, soit que les doses sont insuffisantes pour être détectées. Ces résultats sont extrêmement encourageants dans la perspective d'un traitement localisé ne devant pas entraîner d'effets secondaires.

- Etude pharmacologique

L'évaluation de l'activité anticancéreuse des microsphères chargées a été menée sur un modèle de tumeur, le gliome C6 du rat, induit par injection stéréotaxique de cellules gliales C6 dans le parenchyme cérébral. Quand ces microsphères sont implantées au sein de gliome chez le rat, elles font preuve d'une activité thérapeutique significative par rapport aux contrôles et en particulier par rapport à une injection intracérébrale d'une solution de 5-FU. L'activité antitumorale des microsphères de PLAGA-5-FU est par contre quasi nulle quand elles sont implantées dans un gliome greffé en sous-cutané. Celà montre bien le rôle de la BHE qui empêche le 5-FU libéré de diffuser en systémique en le maintenant au plus près de ses cibles.

- Etude clinique

"Au stade où nous en étions rendus dans l'expérimentation animale et devant le pronostic dramatique des tumeurs gliales malignes, une étude clinique ouverle de phase 1a été mise en place au CHU d'Angers.
Le passage à une phase de développement de la préparation des microsphéres de PLAGA-5-FU a été nécessaire. la quantité maintenant produite en une fois permet de traiter une dizaine de patients tout en effectuant de façon concomitante les contrôles inhérents à ce genre de forme galénique. Cette fabrication se fail en respectant les Bonnes Praliques de Fabricalion au sein de la Pharmacie Cenlrale du CHU d'Angers. les paramètres opératoires de la fabrication ont été ajustés de façon à ce qu'à l'issue de la radioslérilisation. le taux d'encapsulation el surtout le profil de libération du 5-FU soient identiques à ceux des microsphéres non stérilisées étudiées chez l'animal.
Un lot de microsphéres n'est délivré au service de Neurochirurgie qu'après avoir satisfait aux exigences d'un contrôle portant sur la stérilité de la forme galénique, le taux d'encapsulation du 5-FU, la granulomètrie, le taux de salvant organique résiduel dans les micro-sphères, l'analyse des profils de libération in vitro.
L'élude pilote ouverte de phase 1 a été réalisée chez des patients répondant aux critères d'inclusion suivants : patients de 18 à 68 ans, porteurs d'une tumeur gliale maligne sustentorielle, confirmée par l'examen histologique extemporané, dont l'exérèse chirurgicale est complète, nécessitant une radiothérapie cérébrale.
Huit patients ont été traités par implantation de microsphères de PLAGA chargées en 5-FU, dans les parois du foyer opératoire. Dans ce premier essai, l'implantation s'est faite en per-opératoire sans mettre en oeuvre la stéréotaxie. Une radiothérapie cérébrale conventionnelle a été initiée entre le deuxième et le septième jour suivant l'implantation-.Trois patients ont été traités avec une première dose de 5-FU de 70 mg (groupe I), cinq avec une seconde dose de 132 mg (groupe II ).
Le traitement a bien été toléré. les dosages plasmatiques de 5-FU confirment le faible passage de l'anticancéreux dans la circulation générale.
A la dernière évaluation, la médiane de survie était de 98 semaines. Dans le groupe I, 2 patients sont décédés d'une récurrence locale de la tumeur 61 et 125 semaines après l'intervention. Le 3ème patient est décédé à 114 semaines de métastases pulmonaires du glioblastome. Dans le groupe II, un patient est décédé 31 semaines après l'intervention en raison d'une large diffusion des cellules cancéreuses dans l'hémisphère droit. Selon les critères d'inclusion définis plus haut, ce patient n'aurait sans doute pas du être inclus. 2 patients sont décédés à 59 et 82 semaines d'une récurrence éloignée du foyer tumoral initial. Enfin, les 2 autres patients du groupe II étaient en rémission complète à respectivement 139 et 153 semaines. Ces données laissent à penser que la zone péritumorale a été totalement "nettoyée" des cellules tumorales résiduelles. 

Perspectives dans le traitement des glioblastomes et des maladies neurodégénératives

"Nous venons d'initier une étude clinique de phase llb multicentrique pour mieux apprécier l'efficacité thérapeutique de ce type de traitement. 60 patients vont être inclus : 30 traités selon le protocole de référence (chirurgie et radiothérapie), 30 traités par implantation de microsphéres de 5-FU en complément de la chirurgie et de la radiothérapie. Parallèlement, nous débutons une deuxième étude de phase 1 chez des patients inopérables, chez lesquels les microsphères vont être administrées par stéréotaxie.
Dans un autre ordre d'idée, il est connu que de nombreux facteurs neurotrophiques conditionnent des événements biologiques tels que le développement embryonnaire, la régénération nerveuse. Ces facteurs sont des protéines qui ont des caractéristiques ne leur permettant pas d'être actives au niveau de leurs tissus cibles après administration systémique. Ils ne passent pas la BHE, ils ont une demi-vie biologique fugace, leur action est spatialement définie dans le SNC.
Toute stratégie permettant d'amener ces protéines dans un territoire précis et pendant un temps suffisamment long serait du plus grand intérêt. D'où le concept de microsphéres véhiculant ces facteurs trophiques, implantables par stéréotaxie, qui entre parfaitement dans le cadre de nos recherches.
A plus long terme, ce thème pourrait nous amener à proposer des solutions thérapeutiques à des maladies neuro-dégénératives bien connues comme la maladie d'Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique ou encore la maladie de Parkinson", conclue Jean-Pierre BENOIT. 

"Parfois la mariée est vraiment belle"

Le docteur Bruno LHOTE, directeur des produits oncologiques du laboratoire pharmaceutique ETHYPHARM ( leader européen des formes galéniques utilisées par l'industrie pharmaceutique pour les médicaments à effets retards) qui produit les microsphéres de 5-FU, précise : "Nous avons fait passer ce produit de "fabrication à la paillasse'à un stade de production industrielle. Dans le même temps, de produit expérimentai, il deviendra sans doute médicament déposable en Europe, aux Etats-Unis et au japon. The 0rphan Drug Status, le statut des médicaments orphelins, a été accordé aux Etats-Unis et va l'être bientôt en Furope.
Si ce médicament marche, et il n'y a pas de raison pour qu'il ne marche pas, ce sera à mettre au crédit des chercheurs franco-français... L'inventivité de ceux-ci en terme de traitement du cancer est d'ailleurs très souvent soulignée dans toutes les communautés internationales !
Avec ce 5-FU, utilisé dans le traitement des glioblastomes, tous les espoirs sont donc permis."

LEXIQUE :

Copolymère : Macromolécules renfermant des motifs monomères différents. Copolyméres des acides lactique et glycolique [poly(acide lactique) PLA et copolymères PLAGA] seule série de polymère pouvant être utilisés aujourd'hui dans la formulation d'implants parentéraux biodégradables en médecine humaine, et connus sous le nom de poly(a-hydroxyacides).

Parentéral, aux : qui se fait par une voie nécessitant l'effraction de tissus, en parlant de l'administration d'un médicament (voie intraveineuse, intramusculaire... ).

Galénique : Science qui permet de trouver pour chaque principe actif la présentation médicamenteuse la mieux adaptée au traitement d'une maladie déterminée

Gliome : Tumeur primitive du système nerveux développée à partir de la glie. La glie est l'ensemble des cellules nerveuses interstitielles assurant diverses fonctions métaboliques et de soutien qui constituent, avec les neurones, le tissu nerveux.

lnterstitiel : Se dit de formations cellulaires situées entre les cellules parenchymateuses (tissu formé de cellules différenciées, doué d'une fonction physiologique spécifique, tel le parenchyme rénal) des organes ou de substances qui séparent les cellules des tissus de type conjonctif.